iPSC编辑WGBS检测

iPSC编辑WGBS检测

1. 背景介绍

1.1 核心定位

WGBS(全基因组亚硫酸氢盐测序)以单碱基分辨率和全基因组覆盖的独特技术优势，为iPSC来源细胞治疗产品提供符合监管要求的表观遗传质量控制。适用于iPSC来源的心肌细胞、神经细胞、视网膜色素上皮细胞、β细胞、NK细胞等细胞治疗产品的全面表观遗传安全性评估。

1.2 iPSC细胞治疗产品的临床转化进展

诱导多能干细胞(iPSC)来源的细胞治疗产品已进入临床转化快车道。全球已有多项iPSC来源产品进入临床试验，包括:

（1）iPSC来源视网膜色素上皮细胞(RPE)治疗黄斑变性；

（2）iPSC来源心肌细胞治疗心力衰竭；

（3）iPSC来源多巴胺神经元治疗帕金森病；

（4）iPSC来源NK细胞/CAR-NK细胞治疗肿瘤；

（5）iPSC来源β细胞治疗糖尿病。

1.3 iPSC产品面临的独特表观遗传挑战

iPSC产品面临三类关键的表观遗传安全性挑战，这些挑战可能影响产品质量、安全性和临床疗效:

（1）挑战一: 表观遗传记忆(Epigenetic Memory)

Nature(2010年)里程碑研究首次证实: 低传代iPSC保留供体组织来源的DNA甲基化特征，这种"表观遗传记忆"会影响细胞的分化潜能和功能均一性。

（2）挑战二: 重编程诱导的异常甲基化(De novo Aberrant DMRs)

重编程过程不仅不能完全擦除供体细胞的甲基化印记，还会在iPSC中引入新的异常甲基化区域。研究表明88%的高甲基化DMR可传递至分化的终末细胞，可能影响iPSC的分化能力和分化产物的功能。

（3）挑战三: 印记基因甲基化异常

印记基因(Imprinted Genes)的表达依赖于亲本特异性的DNA甲基化模式。iPSC重编程和长期培养可能导致印记控制区(ICR)的甲基化丢失或异常获得，引发与肿瘤发生、发育异常相关的印记缺陷。

2. WGBS检测原理

2.1 为什么iPSC产品必须进行WGBS检测

iPSC产品的表观遗传质量控制需要全基因组水平的评估，原因如下:

(1) 表观遗传记忆、异常DMR和印记基因缺陷可能出现在基因组的任何位置

(2) RRBS和甲基化芯片的有限覆盖可能遗漏关键的异常甲基化区域

(3) 监管机构要求全面的表观遗传表征数据以支持IND/BLA申报

(4) 只有WGBS能够提供单碱基分辨率的全基因组甲基化图谱

WGBS是唯一能够全面评估iPSC表观遗传质量的技术：

2.2 WGBS技术优势

为什么WGBS是iPSC产品表观遗传质量控制的金标准？

关键结论：对于iPSC产品，只有WGBS能够全面评估表观遗传记忆、异常DMR和印记基因完整性，这是监管机构要求的产品质量关键质量属性(CQA)。

2.3 WGBS检测技术原理

WGBS 核心是通过重亚硫酸盐化学转化实现甲基化 / 未甲基化胞嘧啶的单碱基区分，结合高通量测序和生物信息学分析，构建全基因组单碱基分辨率的 DNA 甲基化图谱，整体原理按样本前处理、DNA提取与文库构建、重亚硫酸盐核心转化、高通量测序、生信分析与甲基化鉴定这几大核心步骤：

图1 WGBS检测技术流程图

3. 技术创新与优势

3.1 优化的文库构建与测序策略

（1）针对iPSC样本的技术优化

（2）测序深度选择指南

3.2 专业生物信息学分析流程

（1）标准分析模块

（2）iPSC产品专属分析

4. 应用场景与检测方案

4.1 检测时机与样本设计

iPSC产品的表观遗传质量控制应贯穿整个制备流程，从供体细胞到最终分化产品:

4.2 核心分析内容

（1）多能性相关甲基化评估

多能性标志基因启动子分析:

（2）表观遗传记忆评估

供体组织特异性甲基化残留分析:

1.供体细胞 vs iPSC的全基因组DMR分析

2.组织特异性基因启动子的甲基化状态变化

3.谱系特异性增强子的甲基化擦除程度

4.与ESC参考的相似度评分

（3）重编程质量评估

与ESC参考的全基因组甲基化比较:

（4）印记基因完整性分析

关键印记控制区(ICR)甲基化定量:

1.已知人类印记区域(>100个)的甲基化状态

2.等位基因特异性甲基化分析(需高深度或联合SNP分析)

3.异常印记位点的功能影响评估

（5）分化终产品表观遗传评估

5. 监管支持与服务内容

5.1 FDA监管框架

根据FDA和ICH指南，iPSC来源细胞治疗产品的CMC(Chemistry, Manufacturing and Controls)部分需要全面的产品表征。FDA对iPSC产品表观遗传表征的期望:

5.2 CDE/NMPA监管要求

中国CDE《人源性干细胞及其衍生细胞治疗产品临床试验技术指导原则(试行)》明确要求:

（1）对复杂体外操作的干细胞产品，建议在适当阶段评估遗传和表观遗传稳定性

（2） 对于多能干细胞来源产品，建议进行全基因组水平的表观遗传组分析以评估风险

（3）鼓励采用核型分析结合全基因组水平检测方法进行质量控制

5.3 监管申报支持

符合IND/BLA申报要求的数据包

专业技术支持服务

1.项目设计咨询: 根据产品类型和监管要求设计最优检测方案

2.样本策略建议: 样本类型、数量、时间点的科学设计

3.数据解读支持: 协助解读分析结果的生物学和监管意义

4.审评问询支持: 协助准备监管机构的技术问询答复

5.多组学整合: 可与RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq等数据联合分析

6. 样本要求

DNA样本标准

细胞/组织样本(可代提DNA)：

①所有样本须符合上述质量标准，以确保检测结果的准确性和可靠性；②对于特殊样本类型，请提前与舒桐技术团队沟通(电话 400-6309596；产品订购/技术支持 service@generulor.com)

7.参考文献

1. Kim K, et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 2010;467(7313):285-290.

2. Polo JM, et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 2010;28(8):848-855.

3. Lister R, et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 2009;462(7271):315-322.

4. Jha BS, et al. Regulatory considerations for developing a phase I investigational new drug application for autologous induced pluripotent stem cells-based therapy product. STEM CELLS Transl Med. 2021;10(2):198-208.

5. Kaneko S, et al. Considerations for the development of iPSC-derived cell therapies: a review of key challenges by the JSRM-ISCT iPSC Committee. Cytotherapy. 2024;26(9):913-927.

6. CDE/NMPA. 人源性干细胞及其衍生细胞治疗产品临床试验技术指导原则(试行). 2023.