三代WGS全基因组SV检测

三代WGS全基因组SV检测

1. 三代WGS全基因组SV检测技术背景介绍

随着CRISPR等基因编辑技术在基因治疗领域的广泛应用，其潜在的安全性风险日益受到各国监管机构的高度重视。CRISPR切割产生的双链DNA断裂（DSB）在修复过程中可能导致染色体重排易位事件，包括染色体大片段缺失、外源DNA片段插入以及染色体易位。美国食品药品监督管理局（FDA）已明确强调了对染色体重排易位检测的重要性，因为这些事件可能导致严重的不良反应，包括基因组不稳定性增加、遗传疾病风险增加、治疗失败以及其他不可预测的后果。

图1 FDA《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》安全性评估关于染色体结构异常检测的指导

二代测序技术（NGS）在基因组研究中取得了显著进展，但它也存在一定的局限性，尤其是在检测结构变异方面。由于其读取长度较短，二代测序对于复杂的基因组结构，如大片段插入、缺失、倒位以及染色体重排的检测存在一定的挑战。此外，二代测序通常难以有效覆盖基因组中的高重复区域或GC含量较高的区域，这使得在这些区域内的结构变异容易被漏检或误判。因此，二代测序技术在处理复杂变异时的精确性和全面性受到一定限制。

相比之下，三代测序技术（Third Generation Sequencing, TGS）在基因编辑安全性评估中具有显著优势。珠海舒桐科技推出的三代WGS全基因组测序平台，专为全面检测基因编辑后的多种结构变异事件而设计。TGS技术能够提供更长的读取长度，使其在识别复杂的结构变异和脱靶效应时表现更为出色。它能够更好地覆盖高重复区域和复杂基因组区域，有助于全面检测基因编辑过程中的潜在脱靶变异，确保基因编辑的准确性和安全性。凭借其高精度，TGS技术为基因编辑安全性评估提供了更加可靠和深入的分析手段，为基因治疗产品的监管审批提供全面可靠的数据支持。

2. 三代WGS检测原理

三代WGS全基因组检测SV项目采用了先进的长读长测序技术流程，确保对结构变异的全面精确检测。首先，使用Covaris® g-TUBE将高分子量基因组DNA打断成合适长度的DNA片段，这一步骤控制了DNA片段的一致性和适宜性。随后，利用磁珠富集纯化方法对DNA片段进行损伤修复和末端修复处理，提高后续测序的准确性。

在DNA片段两端连接专门设计的测序接头后，通过Bluepipin或Sage ELF等专业设备进行DNA片段筛选和进一步纯化，确保测序文库质量。最后，按照严格的文库定量流程，利用特定的测序引物和酶促反应复合物进行高通量测序。

3. 三代WGS检测SV优势

3.1 全面捕获多种基因编辑事件

相比于其他技术，三代WGS全基因组测序技术在结构变异检测方面具有显著优势：

(1) 检测范围全面：可同时检测多种类型的结构变异（SV），包括大片段缺失(DEL)、插入事件(INS)、重复(DUP)以及断点(BND)，实现结构变异的全谱系检测；

(2) 超长读长优势：平均读长超过20kb，能有效跨越复杂的重复区域和结构变异区域，解决传统技术难以覆盖的基因组复杂区域问题；

(3) 数据比对效率高：测序数据比对效率高达99%以上，确保结果的可靠性和全面性；

(4) 高测序深度覆盖：平均测序深度超过30X，为低频结构变异的检测提供了有力保障；

(5) 高质量测序数据：高比例的读段质量分数达到优质水平，确保数据分析的准确性和可靠性。

3.2 技术互补性

PEM-seq技术由于引物设计距离切割位点较近(50-110bp)，可能无法有效检测引物位置的大片段缺失事件，存在检测盲区。而二代Long-range PCR技术虽然通过在切割位点远端(约5kb处)设计引物，有效弥补了这一技术局限，但仍然受限于PCR扩增和短读长测序的固有缺陷。

三代WGS全基因组测序技术通过提供超长读长和全基因组无偏覆盖，不受引物设计限制，能够全面检测各类结构变异，包括大片段缺失、插入事件、重复以及断点。该技术既可独立应用，也可与PEM-seq等方法形成互补，共同构建完整的基因编辑安全性评估体系，为sgRNA依赖型和非依赖型结构变异提供全面检测方案。

3.3 服务优势

(1) sgRNA脱靶位点全面预测：采用先进算法对sgRNA潜在的脱靶位点进行全面预测，并按照DNA错配数和indel数量进行精确统计，为基因编辑安全性评估提供关键数据支持；

(2) 体细胞SV精准检测：采用自主开发的分析流程进行结构变异检测，可同时识别多种结构变异类型，检测的最小SV长度可达50bp，满足精细结构变异分析需求；

(3) 变异分类与注释：采用国际领先的注释系统对结构变异进行功能注释，精确评估变异对基因功能的影响程度，为后续分析提供科学依据；

(4) 完整数据解读：提供在靶/脱靶位点的结构变异分析，区分sgRNA依赖型和非依赖型SV，并通过图表直观展示SV在全基因组上的分布情况；

(5) 全面质控体系：从原始数据质控到数据比对，再到SV检测与注释，建立了完整的质控流程，保证数据和结果的可靠性；

(6) 规范化报告输出：提供包含测序质量指标、数据比对信息、结构变异检测结果及注释的完整报告，支持FDA等监管机构对基因编辑安全性评估的技术要求。

4. 技术应用场景

4.1 应用领域

三代WGS全基因组测序技术凭借其超长读长和全面检测能力，在多个领域展现出独特价值：

(1) 基因编辑产品安全性评估：作为基因治疗产品开发的关键技术，三代WGS可全面评估CRISPR、TALENs等基因编辑技术的脱靶效应和结构变异，满足FDA等监管机构对IND申报的安全性要求。同时，在新型核酸药物开发过程中，可评估药物对基因组完整性的潜在影响；

(2) 复杂结构变异与难测区域研究：对于复杂的基因组重排、染色体易位以及高GC含量、高度同源和重复序列丰富等传统技术难以覆盖的区域，三代WGS提供了理想的检测方案，特别适用于癌症研究和罕见病致病机制探索；

(3) 高级基因组研究应用：利用超长读长优势，三代WGS能够改进基因组组装、填补基因组空缺，并可直接检测DNA甲基化等表观遗传学修饰，为生命科学基础研究和精准医学提供更完整的基因组信息基础。

4.2 成功案例

舒桐科技已成功为多家公司提供全流程的基因编辑安全性评估服务，包括三代WGS数据分析及监管文件准备，协助其CAR-T产品顺利完成FDA的IND申报并获得监管认可。此外，我们还为多家国内外基因治疗企业提供了基因编辑安全性评估服务，支持多个产品的IND申报和临床研究。

5. 示例报告

舒桐科技提供的三代WGS分析报告采用标准化格式，确保数据呈现的专业性与完整性。报告前部分包含项目背景介绍、三代WGS技术原理、建库流程说明以及生物信息学分析流程概述，为客户提供必要的技术背景。随后是样本信息与测序数据统计部分，详细记录样本基本信息、原始测序数据质控指标以及比对参考基因组的结果统计，确保数据质量可靠性。除此之外，报告还包含以下核心内容：

(1) 使⽤Cas-offider对sgRNA潜在的脱靶位点进⾏预测，并对每个sgRNA的脱靶位点，按照DNA错配数和indel数量进⾏数量统计。

图2   三代WGS示例报告（脱靶预测）

(2) 鉴定得到的所有SV事件分类及统计，同时对⾮sgRNA依赖型SV进⾏变异结局注释，对注释结果为High的SV进⾏展示。

图3   三代WGS示例报告（各个类型的SV数量统计）

图4 三代WGS示例报告（⾮sgRNA依赖型SV事件）

6. 三代WGS检测服务内容

*服务周期：标准流程35-45个工作日；

*服务特色：可提供从sgRNA设计到结果分析的一体化服务支持。

7. 样本要求

*注：①所有样本必须符合上述质量标准，以确保检测结果的准确性和可靠性；②客户也可以寄送细胞渣样本用于DNA提取，细胞渣要求>2×10^6/位点；③对于特殊样本类型，请提前与舒铜技术团队沟通（电话 400-6309596；产品订购/技术支持 service@generulor.com）。

参考文献

[1] Niedringhaus, T. P., Milanova, D., Kerby, M. B., Snyder, M. P. & Barron, A. E. Landscape of Next-Generation Sequencing Technologies. 4327–4341 (2011).

[2] Rothberg, J. M. et al. An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing. Nature 475, 348–52 (2011).